Grundsätzlich wird die Ausführung des Skripts langsamer; ist ja auch logisch, wenn man den zusätzlichen Aufwand bedenkt, der dahinter steckt.

Allerdings ist der Unterschied für gewöhnlich nicht so gravierend, als dass es sich lohnen würde die Wartbarkeit und Wiederverwendbarkeit deines Codes für etwas erhöhte Geschwindigkeit zu opfern. Es lohnt sich schon unter dem Gesichtspunkt der Vereinfachung deiner eigenen Arbeit eigenständige Funktionen / Module / Klassen in eigene Dateien auszulagern. Zumal die bereits geladenen PHP-Dateien vom Betriebssystem nicht einfach wieder aus dem Speicher gelöscht werden, sondern dort bei regelmäßiger Nutzung gecached bleiben.
Im Übrigen lagert wohl jedes größere PHP-Framework seine eigenständigen Klassen in eigene Dateien aus.

So lange du also keine absolute Echtzeit-Anwendung programmierst, oder jede Zeile Code auslagerst, wird dich die Unübersichtlichkeit einer großen PHP-Datei mehr nerven, als das bisschen verlorener Zeit bei der Ausführung den Benutzer.

PS: Am Besten misst du den zeitlichen Unterschied selbst, indem du dir mittels der Funktion microtime [php.net:microtime] ein kleines Skript zusammenstellst.

evilwm hat alles korrekt gesagt.
Es sei zu betonen, dass jede gute Webanwendung in viele, viele PHP Dateien (Pro Klasse eine Datei) aufgeteilt wird.

Als Programmierer sollte man alles als Black Box sehen und die Mittel nutzen die einem zur Verfügung stehen.
Wenn du nachforschst wirst du herausfinden. dass es soetwas wie ein Dateisystemcache gibt, dass moderne PHP Versionen die Dateien als kompilierte Versionen vorhalten, uvm